利用流式細胞儀增強細菌研究

將流式細胞儀添加到您的平臺庫中進行微生物研究可以闡明傳統大量觀察所未見的方面。各行各業使用流式細胞儀研究微生物生物學,如生物醫學科學,食品安全和遺傳學。流式細胞儀可以幫助臨床醫生檢測細菌感染并確定對抗生素的易感性,公共衛生機構使用流式細胞儀檢測水或食物中的致病菌,流式細胞儀也可用于利用細菌作為載體進行遺傳研究。用于檢查細菌的常規方法基于在瓊脂上生長時對單細胞形態或集落特征的觀察。然而,高靈敏度的流式細胞儀提供了檢測和分析微生物的工具,與其可培養性無關,因為并非所有微生物都會在瓊脂上同等生長。在這里,我們將重點介紹使用流式細胞儀進行微生物研究的一些優勢,并概述一些實驗提示和技巧,以便快速啟動您的研究。

使用流式細胞儀進行微生物研究的好處

單細胞分析

流式細胞術是一種允許人們快速和單獨分析細菌的技術,同時提供微生物異質性的定量分析。傳統的單細胞細菌分析方法在分析單個細胞的能力方面受到限制,而耗時的顯微鏡限制了可以分析的細胞總數。另一方面,流式細胞術能夠每秒分析數千個細胞,改善統計學,并允許量化獨特和稀有細胞類型。

**細胞計數

使用流式細胞儀進行細菌細胞計數與傳統計數方法(例如顯微鏡檢查,細胞質量測定或光密度讀數)相比,在速度和準確度方面具有顯著優勢。流式細胞儀可以通過直接體積計數或添加計數珠來獲得微生物的細胞計數。此外,通過將細胞計數與其他測量(例如生存力或大?。┡悸?,可以容易地確定特定細胞亞群的細胞計數。

多參數分析

使用流式細胞儀進行細菌鑒定的一個優點是能夠進行多參數分析。光散射特性可以揭示細菌的大?。‵SC)和復雜性(SSC),然而,通過與特定熒光染料(例如DNA含量,細胞活力和膜電位)同時分析可以獲得額外的信息。這些附加參數可以為細胞健康,生長以及區分混合培養物中不同種類細菌的能力提供有價值的見解。

使用流式細胞儀分析細菌的提示和技巧

在流式細胞儀上檢測細菌

適當的PMT電壓設置/范圍

流式細胞儀能夠分析從大的培養細胞系到小于1μm的微生物的各種各樣的顆粒。許多儀器不能同時收集大范圍的信號,因此必須優化光電倍增管(PMT)電壓設置以確保正確收集樣品,尤其是細菌等小顆粒。一些新的流式細胞儀,例如NovoCyte®,具有廣泛的信號檢測范圍,無需進行復雜的PMT電壓調整,傳統上僅供有經驗的人使用。使用具有這種寬動態范圍信號檢測的流式細胞儀簡化了實驗設置,并確保了足夠的PMT設置,適用于廣泛的檢測。

正確的閾值設置

流式細胞儀圖

圖1.使用NovoCyte®流式細胞儀檢測天然水中的細菌將
新鮮天然水通過300目篩過濾,用去離子水稀釋(通過0.1μm膜過濾)**所需濃度。向樣品中加入100xSYBR®GreenI染料,在37℃下孵育13分鐘,并在NovoCyte流式細胞儀上獲得。綠色與紅色的情節通過細菌與背景區分。在每個樣品中自動獲得**計數。

為確保信號收集是特定的,使用閾值來消除背景噪聲。閾值是電子障礙,它建立了是否記錄事件的標準。正確確定閾值非常重要,因為任何不符合此標準的內容都不會顯示或保存以供分析。前向或側向散射通常用作閾值參數,因為不需要額外的試劑。然而,細菌可能因其尺寸小而成為問題,并且難以將它們與背景或碎片區分開來。如果是這種情況,建議使用熒光信號(即熒光觸發)設置閾值,以專門識別細菌并確保與碎片分離。通過熒光進行的細菌檢測通常包括與核酸結合的染料,例如SYBR Green I,Sytox Green I等。用SYBR Green熒光引發以檢測水中的細菌污染,如圖1所示。該圖顯示了細菌的充分區分。由電子噪聲和無機粒子引起的背景??傊?,使用適當的閾值設置,您可以確保樣品的質量數據采集。

在流式細胞儀上獲得細菌細胞計數

流式細胞術也可用于獲得準確的**細胞計數,或整個群體或細胞亞群中細胞的濃度。目前,大多數流式細胞儀依賴于計數微珠作為參考顆粒來計算細胞計數,然而,一些流式細胞儀具有直接體積細胞計數而無需計數珠子。這兩種方法都可以產生精確和準確的**細胞計數,但直接體積計數可以提供細胞計數,而無需額外的試劑或增加實驗復雜性。計數珠具有確定的濃度,其允許獲取一定數量的珠子事件,并使用該數量來計算樣品中的細胞濃度。計數珠子有各種尺寸,有熒光和沒有熒光。如果您打算使用熒光觸發,那么使用具有類似熒光的計數珠也很重要。對于直接體積計數,通過流式細胞儀自動計算細胞濃度,無需任何額外步驟,通常使用非常精確的注射泵??偟膩碚f,兩種細胞計數方法都會產生快速且易于實現的**計數。

細菌的多參數分析

雖然單獨的光散射可以提供有價值的信息,但使用特定熒光染料或標記物的多參數分析的添加提供了關于活力,代謝活性,細胞應激反應和細胞周期分析的進一步見解。但是,在使用熒光分析細菌時,需要記住一些重要特性。對于細菌而言,細胞分析所需的熒光試劑可能與哺乳動物細胞不同,或者可能需要改變使用的濃度。細菌的大小,質量,核酸和蛋白質含量約為哺乳動物細胞數量的1/1000,因此信號可能受到影響。細菌在與細胞計數用試劑的相互作用中也往往與真核生物的行為不同; 這可能是由于試劑的攝取和流出不同引起的,這些試劑受到細胞壁結構的影響以及可能與真核生物中的那些不相似的孔/泵的存在。其中一個例子是革蘭氏陰性細菌的外膜排除了更多的親脂性和親水性分子,通常用于測量膜電位。因此,重要的是憑經驗確定細菌染色所需的試劑濃度,并確保其可用于微生物分析。

結論

包括用于微生物研究的流式細胞術可以增強實驗結果,提供執行單細胞多參數分析以及**細胞計數的能力。使用本說明中提供的技巧將有助于防止流式細胞儀上微生物分析中出現的許多缺陷。

Lauren Jachimowicz是ACEA Biosciences的應用開發科學家。

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