下一代測序的樣品數量和質量控制

輸入樣品的數量和質量是下一代測序中成功制備文庫的兩個關鍵考慮因素。高質量的文庫是減少測序偏倚和提供可靠序列覆蓋的重要因素。因此,樣本輸入的強大量化和質量控制程序對于確保通過工作流程獲得一致結果和**大化序列發生器吞吐量**關重要。

特殊性,靈敏度,所需樣品量,成本和速度等因素都是選擇QC方法時需要考慮的重要因素。了解熒光和吸光度定量技術的優勢和局限并適當使用它們將確保成功的質量控制工作流程。

微量體積UV-Vis吸光度

通過吸光度定量核酸是通過分析透過樣品的光量來進行的。核酸的吸收峰在260nm,并且在該波長下吸收的光量可以直接用于使用Beer-Lambert方程計算樣品的濃度。

吸光度還提供樣品污染的指示,因為吸收光譜的形狀將基于吸收與目標分子相同或接近相同波長的其他分子的存在而改變。

對于基因組學和蛋白質組學應用,微量分光光度計是優選的,因為測量快速,樣品體積要求**?。?μL或更低),并且消除了對樣品稀釋的需要。

使用吸光度方法定量核酸的一個限制是260nm處的峰值吸光度對于所有核酸種類是常見的。例如,dsDNA樣品中任何污染的ssDNA,RNA,游離核苷酸或寡核苷酸都會增加報告的濃度。因此,單獨的吸光度方法**適合于純化樣品的定量。

熒光定量

熒光方法通常使用對目標生物分子具有選擇性的熒光團。當與靶標結合時,熒光團顯示增強的熒光,允許特異性檢測目標分子。

熒光測定使用該結合特異性來建立樣品發出的熒光量與溶液中感興趣的生物分子濃度之間的直接相關性。通過將熒光團與已知濃度的樣品混合并測量相對熒光單位(RFU),可以繪制濃度和測量的RFU之間的關系并將其用作標準曲線。然后可以將與未知樣品結合的相同熒光團的發射相對于該標準曲線作圖,以確定樣品濃度。

熒光檢測的選擇性是熒光的關鍵優勢,使研究人員能夠確保定量數據特異于其感興趣的樣品。

Denovix觸摸屏

預定義的應用程序可以快速,輕松地測量吸光度和熒光,以及強大的數據導出功能

由于熒光團的高消光系數,熒光測定也非常敏感。例如,使用DeNovix DS-11 FX和dsDNA定量分析,可以檢測原始樣品中低**0.5 pg /μL的dsDNA濃度。與微量吸收方法相比,這是靈敏度提高1000倍以上。

大多數下一代測序儀供應商建議通過分析物特異性熒光測定法(如DeNovix,PicoGreen或Qubit測定)對輸入樣品進行定量。這些方法利用對dsDNA特異的染料,并且不與可能存在的其他核酸種類結合。

純度評估

除了進行準確的定量外,評估樣品的純度以確保它們不含潛在的酶抑制劑也很重要。蛋白質,EDTA,苯酚,鹽和多糖等污染物會對隨后的酶促反應產生負面影響,導致產量下降,覆蓋率不均勻或不良,甚**造成文庫制備失敗。建議使用微量體積UV-Vis吸光度法進行樣品質量控制。通過評估260 / 280nm和260 / 230nm測量的比率,可以推斷出樣品中雜質的程度和性質的信息。

概要

吸光度方法的優點

  • 快速測量,無需化驗成本。直接測量樣品,無需設置分析或測量標準曲線。
  • 動態范圍寬。對于**靈敏的微量體積分光光度計,檢測下限為0.75 ng /μLdsDNA(DS-11系列,DeNovix)。通過縮短光程(光穿過樣品的距離),可以測量越來越濃的樣品。目前,微量吸收的檢測上限為37,500 ng /μLdsDNA。
  • 樣品純度評估。通過分析260/230和260/280比率可以獲得樣品質量信息。

熒光法的優點

  • 特異性。熒光定量分析特異性結合目標分析物,結果受常見污染物的影響較小。
  • 敏感度。使用熒光分析,檢測限可比微量吸光度低1,000倍。

結論

吸光度和熒光是不同但是用于樣品定量的互補方法。對于NGS實驗室,結合熒光和吸光度方法使研究人員能夠獲得PCR前后樣品質量控制的定量和定性信息,同時使用**少量的樣品。

例如,熒光定量確認是否有足夠的dsDNA模板用于文庫制備,并且260 / 230nm和260 / 280nm吸光度比能夠評估潛在的抑制性污染物。

使用吸光度和熒光的濃度測量之間的差異也可以提供僅在分離目標核酸時提取效率的廣泛指示,因為吸光度值還將包括所有核酸的吸光度(單核苷酸,寡核苷酸,RNA, dsDNA或ssDNA)。

為了滿足下一代測序實驗室的不同需求,DeNovix提供DS-11系列儀器。DS-11 FX獨特地結合了微量吸光度和熒光測量模式。每種方法的獨立系統也可在該范圍內使用,非常適合在PCR前和PCR后具有特定量化要求的實驗室。

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