淺談細胞破碎--高壓勻漿法

摘要:細胞破碎技術是指利用外力破壞細胞膜和細胞壁,使細胞內容物包括目

的產物成分釋放出來的技術,是分離純化細胞內合成的非分泌型生化物質(產品)的基礎。目前已發展了多種細胞破碎方法,以便適應不同用途和不同類型的細胞壁破碎。 破碎方法可規納為機械法和非機械法兩大類。機械破碎主要的方法有珠磨法、高壓勻漿法、撞擊破碎法和超聲波等方法。本文主要介紹高壓勻漿法,高壓勻漿法的應用以及高壓勻漿機的介紹和使用。 

關鍵詞:細胞破碎 高壓勻漿法  高壓勻漿機  影響因素  應用 

1、高壓勻漿法破碎細胞原理 

高壓勻漿法是大規模破碎細胞的常用方法,作用機理是液體剪切作用,利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥,由于突然減壓和高速沖擊撞擊環使細胞破碎,細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時,每秒速度高達幾百米,高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環上,被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中經歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化,從而造成細胞破碎。 

破碎屬于一級反應速度過程,被破碎的細胞分率符合如下公式:                  ln[1/(1-R)]=KNPɑ           

式中  R — 破碎率,為N次循環后,蛋白質的釋放量Rn與**大釋放量Rm之比; 

  K - 與溫度有關的速度常數;   N - 懸浮液通過勻漿器的次數;   P - 操作壓力,MPa;   ɑ- 與微生物種類有關的常數。 

2、高壓勻漿機 

2.1高壓勻漿機工作原理及工作示意圖 

高壓勻漿器是常用的設備,它由可產生高壓的正向排代泵和排出閥組成,排出閥具有狹窄的小孔,其大小可以調節。細胞漿液通過止逆閥進入泵體內,在高壓下迫使其在排出閥的小孔中高速沖出,并射向撞擊環上,由于突然減壓和高速

2.2高壓勻漿機性能特點 

凡與物料相接觸的零部件材料都具有極高的耐磨性和良好的耐腐蝕性、對物料不會產生不良的影響,高壓均質機與其它均質設備相比,具有占地面積小、效率高、能量大、反應時間快、運轉費用低等優點。高壓均質機品種、規格齊全,完全能滿足各個*域用戶的需要。均質功率從1KW-200KW,壓力從15MPa-100MPa,從0.2升物料能做實驗的臺式小型均質機到3萬升/小時超大型均質機,各種規格達一百多種,為全G同行業之**。機器的均質系統分別由一級閥和二級閥組成雙級均質系統,兩者的均質壓力可以在其額定的壓力范圍內任意選擇,兩者可同時使用,也可單獨使用。均質閥的結構可分為平型和W型兩種,平型閥能承受高壓沖擊,具有耐磨性好、使用壽命長等優點。W型閥是一種能在一組閥件內產生多次均質過程結構的閥,大大的提高了其均質效果。泵休閥的結構分球型閥和碟型閥二種,球型具有耐高壓、使用壽命長等優點。碟型具有結構簡單、容積效率高等優點。  主要特點: 

(1)一級勻質閥,可選二級勻質閥  

(2)乳劑和脂質體研究生產單位中得到廣泛使用。  

(3)意大利GEA Niro Soavi公司的高壓勻漿機勻質閥材料為陶瓷,陶瓷閥的使用壽命是高密度硬質合金或碳化鎢的使用壽命3 倍以上。(4)采用電機驅動,而非氣動方式,避免了空氣經壓縮產生的水份進入高壓泵,而導致高壓勻漿機無法正常運行。  

(5)樣品經高壓勻漿后,**終平均粒徑可以達到100 納米以下,且粒徑分布均勻。  

(6)可進行在線清洗(CIP )和在線蒸汽滅菌(SIP ),完全符合FDA要求。  (7)框架式系統按照ASME BPE標準裝配。高壓勻漿機按照ISO9001 質量體系標準生產。  

(8)可進行在位清洗和在線滅菌 技術參數: 

(1)**大工作壓力1500 Bar—— 適合生物工程(酵母細胞破碎、大腸桿菌破碎、絲狀真菌破碎、動物細胞及動物組織細胞破碎)、分子生物學、藥劑、乳業、食品研發及中試等行業使用  (2)產量10L/hr  

(3)電源要求:三相電源,1.1KW /380V /50Hz /3phase  (4)尺寸(mm): W 460 x H 420 x L 800  (5)勻質閥材質:陶瓷  

(6)壓縮頭采用高質量、高強度和耐腐蝕的SAF2507特種雙相不銹鋼制造,能夠在極高的操作壓力穩定持久地工作,不會產生裂紋,有效抵抗腐蝕和機械損傷  (7)設備自重: 85 kg  

(8)按照ISO9001 質量體系標準生產 

3、影響高壓勻漿法破碎細胞的主要因素[4] 

    本部分以高壓勻漿破碎重組大腸桿菌為例子介紹影響高壓勻漿法破碎細胞

去離子水懸浮,勻漿所得的rhIL-6純度比用緩沖液A獲得的rhIL-6純度高出近十個百分點。這可能是因為在去離子水中,細胞內外的滲透壓突然變化,細胞壁容易脹裂,在勻漿作用下更容易釋放包含體另一方面在去離子水中,某些雜蛋白在勻漿作用下更容易裂解成小分子物質離心出去。 

4、高壓勻漿法破碎細胞的應用 

4.1高壓勻漿破碎螺旋藻細胞釋放藻蛋白的研究 

螺旋藻是絲狀的多細胞藍藻,因含有多種對人體有益的營養物質而受到廣泛的關注[1]

。螺旋藻可通過大面積的海水養殖而得,其含量豐富的藻蛋白(藻膽蛋白藻藍蛋白),在化妝品制造業、食品加工等行業中有著巨大的應用潛力,近期的研究還發現藻蛋白對某些疾病有治療作用。從海藻中提取分離藻膽蛋白目前仍是獲得藻膽蛋白的主要途徑,由于藻蛋白為螺旋藻的胞內產物,因此,提取純化藻蛋白采用何種細胞破碎技術是直接影響蛋白提取率的關鍵因素之一。目前用于螺旋藻藻蛋白提取分離過程中的細胞破碎方法主要有超聲波破碎法、高壓勻漿法、反復凍融法、酶溶法和化學試劑法[5]等。但由于超聲破碎,反復凍融,酶融法只適用于實驗室中小規模的細胞破碎,在某種程度上限制了螺旋藻藻蛋白的大規模分離純化。高壓勻漿法是工業上常用的細胞破碎的方法。采用高壓勻漿法破碎螺旋藻進行細胞破碎,釋放藻蛋白過程中的物理和化學因素,包括均漿次數、均漿壓力、藻細胞密度、緩沖液pH 值、懸浮液體系等進行系統研究,并結合該過程的動力學規律,初步確定了大規模破碎螺旋藻細胞,提取藻蛋白的勻漿工藝,為螺旋藻蛋白工業化生產奠定基礎。 

在螺旋藻蛋白產品的生產由實驗室規模擴大到中試規模的過程中,藻細胞的大規模破碎是必須的。只有高壓勻漿破碎或珠磨法才能滿足產業化的要求。經過多次實驗在考察了高壓勻漿對破碎細胞過程的各種影響因素后初步得出高壓勻漿破碎螺旋藻細胞的工藝為:進料藻液密度為150g/L 左右,用磷酸緩沖液懸浮,在80MPa壓力下連續高壓勻漿三次,每次通過勻漿機的裂解液用冰浴冷卻使得勻漿器出口溫度不超過40℃。經過這樣的破碎可得到86% 的藻細胞破碎率和73% 的藻蛋白含量。2.6 高壓勻漿破碎螺旋藻細胞動力學分析高壓勻漿破碎動力學方程為ln[1/(1-D)]=KNbpa[6],式中,D 為細胞破碎率;N 為勻漿次數;p 為勻漿壓力;K、b、a 為勻漿過程參數;N=1 時以ln[1/1 - D]對壓力p 取雙對數作圖得一直線,由直線斜率可得出壓力指數a ,由直線截距可得K ,再作D 與勻漿次數N 、勻漿壓力p 的關聯圖,用**小二乘回歸可求得參數b。 

4.2高壓勻漿破碎釋放重組大腸桿菌提取包含體過程的研究[4]4.2.1 高壓勻漿破碎工藝的初步確定 

在基因工程藥物的生產由實驗室規模擴大到中試規模中,大規模破碎重組大腸桿菌細胞必須用勻漿破碎或珠磨法才能滿足產業化的要求。經過多次試驗,在考察了高壓勻漿對破碎細胞過程的各種影響因素后初步得出高壓勻漿破碎含有rhIL-6包含體的重組大腸桿菌細胞的工藝:菌體濃度150g×L-1左右(目標蛋白表達量為20%) 用去離子水懸浮,在80MPa壓力下,連續高壓勻漿三次 每次通過勻漿機的裂解液用冰浴冷卻 使得勻漿器出口溫度不超過40°C 經過這樣的破碎,表達量為20%的菌種可得到純度為40%的包含體。 4.2.2 高壓勻漿破碎重組大腸桿菌動力學分析 

    Middelberg[5]建立了大腸桿菌高壓勻漿破碎動力學方程 ln[1/(1-D)]=KNbpa,其中D為細胞破碎率,N為勻漿次數,p為勻漿壓力, K、 b、 a 、為勻漿過程參數。N=1時,以ln[1/1-D] 對壓力p 取雙對數作圖,得一直線,由直線斜率可得出壓力指數a,由直線截距可得K。再作D與勻漿次數N,勻漿壓力p 的關聯圖,用**小二乘回歸可求得參數b。下表表為改變高壓勻漿過程中壓力、溫度、濃度、pH及懸浮體系得出的動力學參數總結表。 

    從表可知,重組大腸桿菌細胞高壓勻漿破碎的壓力指數a為1.032>1 小于文獻報道的酵母細胞勻漿壓力指數2.9,未重組大腸桿菌細胞壓力指數2.2[6] ,這說明經誘導的重組大腸桿菌細胞更易破碎,對參數b影響較大的是菌體的懸浮體系 參數k受壓力影響**大


高壓勻漿法操作參數少,且易于確定;且樣品損失量少,在間歇處理少量樣品方面效果好,在實驗室和工業生產中都已得到應用,適用于酵母和大多數細胞的破碎。對于易造成堵塞的團狀或絲狀真菌以及一些易損傷勻漿閥,質地堅硬的亞細胞器一般不適用。

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